如何使用超滤离心管



蛋白质浓缩和替代缓冲液常用的超滤管，微孔（mwco10kd）常用的micon-ultra-15超滤管。根据靶蛋白的分子量、浓缩前的体积和浓缩的靶体积，还可提供不同尺寸和尺寸的其他类型的mwco超滤管。它可以重复使用。1。选择合适的超滤管主要考虑分子量和浓度。通常靶蛋白的分子量不应大于靶蛋白分子量的1/3。例如，当靶蛋白的分子量为35kDa时，可以选择靶蛋白分子量为10kDa的超滤管。如果靶蛋白的分子量约为10kd，则可使用分子量为3kd的超滤管。2。新购买的超滤是干燥的。使用前加入Milliq水。水的体积完全覆盖在膜上，冰浴或冰箱被预先冷却几分钟。倒出水后，可以加入蛋白质溶液。蛋白质添加量不超过管顶白线。超滤管在加入蛋白质溶液前需要在冰上预先冷却。三。平衡。质量和重心都应该平衡。注意速度和加速度不要太快，否则会直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心预冷至4度）。膜和旋转轴的方向根据说明进行调整（对于角向离心机，膜垂直于轴）。在实际应用中，一般的速度开度比手动低，可以延长离心管的使用寿命。4。当浓缩到剩余的1毫升时，取中国产的50μl布拉德福德溶液，加10μl流过，看是否变蓝，以判断UF管是否漏蛋白。如果管道泄漏，重新倒入上层，然后流过新管道开始超滤。为了准确确定管道是否泄漏，用5 mg/ml BSA离心10分钟，然后将其穿过，大致运行胶水或Bradford，继续添加剩余的蛋白质溶液以浓缩（在冰上操作以防止蛋白质加热），直到所有浓缩物都添加完毕。离心过程中应注意是否有蛋白质沉淀，导致堵塞。如果发生沉淀，有必要确定沉淀的具体原因是蛋白质浓度过高还是缓冲液不当。前者可以通过多个超滤管同时超滤来降低浓度，而后者通过改变不同的缓冲液直到没有蛋白质沉淀。5。前几步是用来浓缩蛋白质的。如果要更换缓冲液，当总蛋白溶液浓缩到1毫升左右时，轻轻添加一个新的缓冲液（用0.22um超滤膜超滤后），然后连续浓缩到1毫升左右。浓缩液的最终体积取决于所需的蛋白质浓度，通常不超过500 ul，但也要浓缩到200 ul以下。根据每次至少10次的体积浓度计算，1000次以上的3次基本可以达到更换缓冲器的目的。6。提取最终浓缩蛋白的操作在冰上进行。黄色枪头（200ul）用于提取最终的蛋白质浓缩物。枪头沿枪头边缘轻轻插入。将蛋白溶液轻轻吹匀。注意不要触摸超滤膜。吸取浓缩液，一次最多吸200 ul，直至耗尽。最后留在管底的浓缩液不需要吸收，否则太困难，可能损坏超滤膜。最后，在无超滤膜的超滤管中加入Milliq水，以防止超滤膜干燥。7。下面是处理和重复使用超滤管的步骤。8。将超滤管中的水倒出来，用Milliq水轻轻冲洗几次。[如管底有可见蛋白质沉淀，可先加水，再用枪头吹气，注意不要碰触膜，吹气至沉淀悬浮，再倒出，不要冲自来水。）然后加入0.2 mNaOH溶液，室温放置20分钟，平衡超滤。在此期间定量管。离心10分钟。倒出剩余的NaOH溶液，将管芯浸入Milliq烧杯（1L或2L）中。放置数小时，然后用新水替换，放置数小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管道和盖子用自来水冲洗，内壁用Milliq水冲洗。9。取出浸入水中的芯，并将其加入几乎满毫升的水中。在50毫升试管中注入毫升水。慢慢地将芯放入50毫升离心管中，排出一些水。然后盖上盖子，4度存放，直到下次使用。一般来说，根据上述步骤和注意事项，每根渠道在三到四年内不会受损。